G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES

G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using infra-red, visible or ultra-violet light

G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light

G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited

G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices

G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths

Abstract

The method involves introducing a fluorescent marker in a diffusion medium (20). Excitations of the medium are realized using primary impulsions of a primary excitation beam at a primary wavelength and secondary impulsions of a secondary excitation beam shifted spectrally and temporally from the primary excitation beam, where secondary wavelength of the secondary beam is different from the primary wavelength of the primary beam. A time-resolved fluorescence signal of the marker is detected. An independent claim is also included for a tomography device for detection of a fluorescent marker in a diffusion medium.

Ce dispositif comporte une première source 8 de rayonnement en impulsions et une deuxième source 80 de rayonnement en impulsions. This device comprises a first source 8 of radiation in pulses and a second source 80 of radiation pulses.Chacune de ces sources est de préférence une source laser émettant dans l'infra rouge. Each source is preferably a laser source emitting in the infrared.Du point de vue temporel, la largeur de chaque impulsion (de l'une ou l'autre source) compatible avec l'invention ne doit pas dépasser quelques centaines de femtoseconde (elle est donc inférieure à 10-13s ou à 10-12s) , afin que tous les photons émis par la deuxième source déclenchent simultanément l'excitation du milieu autofluorescent et ceci avant le déclin de la fluorescence du milieu environnant (l'autofluorescence), qui est compris entre quelques centaines de picosencondes et quelques nanosecondes. From the temporal perspective, the width of each pulse (from any source) compatible with the invention should not exceed a few hundred femtosecond (it is less than 10-13s or 10-12s) so that all the photons emitted by the second source simultaneously trigger the excitation of the autofluorescent medium and this before the decline of fluorescence of the surrounding medium (autofluorescence), which is between a few hundred and a few nanoseconds picosencondes.Ceci permet de rendre le milieu environnant majoritairement aveugle à la deuxième impulsion : lorsque celle-ci arrive, une molécule de ce milieu est encore dans l'état électronique excité et il lui impossible de réabsorber un autre photon. This will make the majority of blind surrounding environment to the second pulse: when this happens, a molecule of this medium is still in the excited electronic state and unable to reabsorb another photon.La lumière émise par la première source 8, est envoyée par une fibre 10 vers la cellule 20 qui contient le milieu à analyser. The light emitted by the first source 8, is sent through a fiber 10 to the cell 20 which contains the medium to be analyzed.La lumière émise par la deuxième source 80, rejoint également la fibre 10 et est aussi envoyée vers la cellule 20. Il peut y avoir deux fibres différentes, une pour chaque laser, mais à condition que le point d'excitation soit le même pour les deux faisceaux, ou 14 que les deux faisceaux convergent sensiblement sur une même zone, car ce point ou cette zone va émettre de l'autofluorescence et sera aveugle à la deuxième impulsion. The light emitted by the second source 80, also joined the fiber 10 and is also sent to the cell 20. There may be two different fibers, one for each laser, provided that the excitation point is the same for two beams, or 14 that the two beams converge substantially on a same area, since this point or zone will emit autofluorescence and will be blind to the second pulse.

Les deux sources sont synchronisées par des moyens 17 de synchronisation. The two sources are synchronized by means 17 for synchronization.Les impulsions de la deuxième source sont décalées spectralement par rapport aux impulsions de la première source. The pulses of the second source are spectrally shifted with respect to the pulses from the first source.Par exemple la première source émet à une longueur d'onde d'environ 700 nm (longueur d'onde adaptée notamment au cas de l'excitation de l'intralipide comme source d'autofluorescence, dont le temps de déclin est d'environ 500 ps), tandis que le spectre de la deuxième source est centré à une longueur d'onde d'environ 750 nm. For example, the first source emits at a wavelength of about 700 nm (wavelength adapted in particular to the case of excitation of Intralipid as a source of autofluorescence, whose decay time is approximately 500 ps), while the spectrum of the second source is centered at a wavelength of about 750 nm.Les impulsions de la deuxième source sont décalées temporellement par rapport aux impulsions de la première source par des moyens 81 formant ligne à retard. The pulses of the second source are temporally offset with respect to pulses of the first source through means forming a delay line 81.

De préférence le milieu 20 est visqueux ou fluide. Preferably the medium 20 is viscous or fluid.On donne plus loin, avec la figure 6, un exemple avec une solution eau et intralipide 1%, qui a la même viscosité que l'eau. further given, with reference to FIG 6, an example with a solution of water and 1% Intralipid, which has the same viscosity as water.L'efficacité de la technique est d'autant plus grande que l'on atteint le régime de saturation (décrit plus loin) qui permet l'aveuglement des molécules ; The effectiveness of the technique is all the greater as we reach the saturation conditions (described below) for the blindness of molecules;ce régime est atteint plus aisément dans le cas du solide. this diet is more easily achieved in the case of the solid.Dans ce régime, les molécules du milieu environnent sont aveuglées, à l'état excité. In this scheme, the molecules of the surrounding medium are blinded in its excited state.

Du point de vue temporel, les impulsions d'excitation des deux sources sont distribuées comme représenté schématiquement en figure 4.Les impulsions de la première source sont désignées par I1r celles de la deuxième source 80 par I2. The temporal point of view, the excitation pulses of the two sources are distributed as shown schematically in Figure 4.The pulses from the first source are designated by I1r those of the second source 80 by I2.Chaque impulsion I2 est séparée de l'impulsion I1 précédente par une durée At, fixe, mais réglable à l'aide des moyens 81. De 19 préférence, chaque impulsion du deuxième laser est décalée temporellement de l'impulsion précédente du premier laser d'une durée At (K0), inférieure à la durée caractéristique du déclin de l'autofluorescence ; Each I2 pulse is separated from the previous pulse I1 At a fixed duration but adjustable with the means 19, 81. Preferably, each pulse of the second laser is temporally offset from the previous pulse of the first laser of at a time (K0), less than the characteristic time of the decline of autofluorescence;par exemple, dans le cas de l'intralipide, dont la durée de vie est d'environ 500 ps, la valeur de At sera comprise entre 0 et 500 ps (0<At<500ps)(de préférence quelques ps ou quelques dizaines de ps, par exemple entre 1 ps et 20 ps ou 50 ps ou 100 ps). for example, in the case of Intralipid, whose lifespan is about 500 ps, ​​the value of At is between 0 and 500 ps (0 <At <500ps) (preferably a few ps or tens of ps, for example between 1 ps and 20 ps or 50 ps or 100 ps).

Ce décalage temporel At dépend notamment de la nature du milieu ou des tissus traversés, et en particulier de la durée de déclin de l'autofluorescence. At this time lag depends particularly on the nature of the medium or tissues crossed, and in particular the decay time of autofluorescence.Par exemple cette durée est d'environ 1 ns, dans de la viande (ex vivo). For example, this time is approximately 1 ns in meat (ex vivo).

Pratiquement, le décalage temporel est déterminé, selon les cas de figures, notamment en fonction de la puissance des sources et des propriétés d'autofluorescence du milieu. Practically, the time offset is determined according to the scenarios, in particular according to the power sources and autofluorescence of the medium properties.D'une façon générale, on cherche à ce que la seconde impulsion soit activée lorsque les molécules des tissus sont toujours aveuglées par le premier faisceau, mais aussi à ce que le signal d'auto fluorescence soit suffisamment faible pour qu'il ne soit pas pris en compte par le détecteur de fluorescence (et ce malgré le filtrage). In general, it is desired that the second pulse is activated when the molecules of tissue are still blinded by the first beam, but also that the auto fluorescence signal is low enough that it is not taken into account by the fluorescence detector (despite the filtering).

On cherche à ce que la première impulsion n'excite pas le fluorophore. We seek that the first pulse does not excite the fluorophore.La largeur de bande d'excitation d'un fluorophore étant relativement large, il est préférable, du point de vue spectral, que la première source soit spectralement décalée par rapport à la source d'excitation du fluorophore. Bandwidth excitation of a fluorophore is relatively wide, it is preferable, from the spectral point of view, that the first source is spectrally shifted with respect to the fluorophore excitation source.Le décalage spectral entre les deux faisceaux est par exemple de 50 20 nm ou plus (la valeur de 50 nm est une valeur moyenne de la largeur spectrale de la fluorescence) dans la limite de possibilité de filtrage. The wavelength shift between the two beams is for example of 50 20 nm or more (the value of 50 nm is a mean value of the spectral width of the fluorescence) in the filter can limit.Plus précisément, la longueur d'onde du deuxième faisceau laser est de préférence supérieure à celle du premier faisceau laser, afin de pouvoir filtrer (avec un filtre passe-haut) la fluorescence de l'inclusion, comme expliqué ci-dessous en liaison avec la figure 5. Specifically, the wavelength of the second laser beam is preferably greater than that of the first laser beam, to filter (with a high-pass filter) the fluorescence of the inclusion, as explained below in connection with Figure 5.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel chaque premier faisceau d'excitation a une longueur d'onde inférieure à la longueur d'onde de chaque deuxième faisceau d'excitation. 4. A method according to one of claims 1 to 3, wherein each first excitation beam has a wavelength less than the wavelength of each second excitation beam.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel on réalise, à chaque impulsion du premier faisceau laser, une saturation d'un état excité de molécules du milieu diffusant. 5. A method according to one of claims 1 to 4, wherein is carried out at each pulse of the first laser beam, a saturation of an excited state of molecules of the scattering medium.