Previous studies demonstrated that the difference in speed of activation between the cardiac and skeletal muscle calcium channels can be attributed to the difference in amino acid sequence of the first repeat of the four repeated units of homology. To identify the region in repeat I responsible for the different activation kinetics, we have made series of 'repeat I chimera' DNA constructs systematically, and expressed them in cultured skeletal muscle cells derived from mice with muscular dysgenesis. Analyses of speed of activation have revealed that the third putative transmembrane region (S3) and the linker region between S3 and S4 is critical to determine the speed of activation. Together with the notion that S4 functions as a voltage sensor, we speculate that a change in membrane potential triggers movement of S4, which is transmitted by affecting S3 and its adjacent portion, finally leading to channel openings.Voltage-gated calcium channels contain smaller subunits. When the main s
… Moreubunit (alpha1 subunit) is coexpressed with smaller subunits, functional activity is markedly increased. To understand the molecular mechanism of small subunit function, we have expressed cardiac calcium channel alpha1 subunit alone or together with small subunits. From the results of Northern blots, protein gel electrophoresis, dihydropyridine binding assay, and electrophysiological measurements, we concluded that the small subunits do not affect metabolism of the main subunit, and that they are necessary for proper functional conformation.From cDNA libraries of rabbit brain, we have cloned cDNA encoding a new calcium channel (named BIII). By sequencing the cDNA, we have elucidated the primary structure of BIII calcium channel. This calcium channel showed homology to other voltage-dependent calcium channel. Especially, BIII showed higher similarity to BI and BII brain calcium channel. These three types of calcium channel form a subgroup distinct from dihydropyridine-sensitive L-type calcium channel. When BIII channel is expressed by injecting DNA into cultured skeletal muscle cells derived from mice with muscular dysgenesis, it showed omega-conotoxin sensitive calcium channel activity. Its kinetics and voltage-dependence were similar to those reported for N-type calcium channels. Since the N-type calcium channel is important for neurotransmitter release, cloning of an N-type calcium channel BIII will contribute to future studies of brain function.カルシウムチャンネルは主要部分を形作るαサブユニットと,その他の小サブユニットより構成されている.小サブユニットをαサブユニットに合わせて発現されると,カルシウムチャンネルの活性が増大することが知られているが,その機序は知られていない.このため,心筋カルシウムチャンネルを,単独あるいは小サブユニットと同時にCHO細胞に発現させ,RNAブロッティング,蛋白ゲル,ジヒドロピリジン結合能,電気生理学的解析を行って,小サブユニットの働きを検討した.その結果,小サブユニットはαサブユニットのRNA量・蛋白量に変化を与えることはなかった.小サブユニットはカルシウムチャンネルとして機能するために必要なコンフォーメションをとるために必要であると結論した.興奮収縮連関に関与するリピートIIとリピートIIIを結ぶ部分については,さらに詳細に検討中である.ナトリウムチャンネル・カルシウムチャンネルのイオン選択機構に関しては,さらに多くの実験データを得,現在それらを解析検討中である.とくにナトリウムチャンネルには不活性化を抑制する変異を同時に導入することにより,実験の精度を向上させることが可能であった.2)ウサギ脳を材料として用い,新たなカルシウムチャンネルαサブユニットのcDNAクローニングを行い,その塩基配列を決定することにより,本チャンネルの全一次構造を明らかにした.この脳カルシウムチャンネル(BIIIと命名)は2,339個のアミノ酸残基よりなり,計算による分子量は261kDaであった.本カルシウムチャンネルは他のカルシウムチャンネルと相同性を有している.とくに脳カルシウムチャンネルであるBI,BIIとの相同性が高く,これら3つのカルシウムチャンネルで,ジヒドロピリジン感受性Lタイプカルシウムチャンネルとは異なったサブグループを形成すると考えられた.cDANより,発現プラスミドを作製し,muscular dysgenesisのマウス由来の培養骨格筋細胞に注入することにより,BIIIカルシウムチャンネルを発現させた.発現したカルシウムチャンネルはω-コノトキシンに感受性であり,従来Nタイプとして報告されて来たカルシウムチャンネルと類似の開閉と電位依存性を示した.また単一チャンネルコンダクタンスは14.3pSであった.Nタイプのカルシウムチャンネルは神経伝達物質放出に大きくかかわっていると考えられており,NタイプカルシウムチャンネルのcDNAクローニングは,今後の脳科学の発展に大きく寄与すると考えられる. Less