C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS

Abstract

Qualititive and/or quantititive process for researching in a liquid, semiliquid, gelled, pasty, solid or similar medium microorganisms, present in even extremely small quantities, and installation for application of said process. In the process in accordance with the invention, said products or fluids are first placed in contact with at least one stain having a positive viability used either in isolation or mixed with other substances such as those selected among the group comprising other viability stains, vital stains, antibodies rendered fluorescent and nucleic probes rended fluorescent. After this, a precise count is made to within one unit, together with the measurement of the metabolic state of each marked microorganism, with the aid of a suitable means such as a flow cytometer or image analyzer. Installation for application of said process.

Par quantité extrêmement faible, on entend au sens de la présente invention, un nombre de micro-organismes qui peut être égal à un. For extremely small amount is meant in the sense of the present invention, a number of microorganisms that can be equal to one.

La combinaison de moyens selon l'invention, a l'avantage de permettre la réalisation de dosages en série, rapides à mettre en oeuvre, fiables ainsi que des comptages à l'unité près. The combination of means according to the invention has the advantage of allowing the realization in series of assays, quick to implement, reliable and counts to the nearest unit.Il ne s'agit pas d'une méthode d'évaluation de concentration par rapport à une population standard, il n'est donc pas nécessaire de connaître l'espèce ou le genre du microorganisme avant l'analyse. This is not a concentration evaluation method compared to a standard population, so it is not necessary to know the species or type of microorganism prior to analysis.

Conformément à l'invention, les anticorps mis en oeuvre sont rendus fluorescents par un agent fluorochrome approprié. According to the invention, the antibodies used are made fluorescent by an appropriate fluorochrome.

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Les colorants de viabilité ont pour rôle de marquer sélectivement les micro-organismes vivants. The viability of dyes have the function of selectively marking live microorganisms.

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Les anticorps ont pour rôle de marquer spécifiquement une espèce ou un genre de micro-organisme, que celui-ci soit vivant ou mort. Antibodies have the role of specifically labeling a species or type of microorganism, that he is alive or dead.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le traitement préalable est constitué par l'action d'un tampon d'ajustement du pH du milieu. According to an advantageous arrangement of this embodiment, the pretreatment is formed by the action of a medium of pH-adjusting buffer.

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Selon une modalité avantageuse de cette disposition, le tampon d'ajustement du pH est utilisé également en tant que milieu de solubilisation. According to an advantageous form of this arrangement, the pH adjusting buffer is also used as a solubilizing medium.

Dans ces conditions, l'intensité de fluorescence de chaque microorganisme est fonction de sa vitalité. Under these conditions, the fluorescence intensity of each microorganism is based on its vitality.

L'installation conforme à la présente invention a, elle, l'avantage d'améliorer la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention à l'échelle industrielle. The installation according to the present invention, it has the advantage of improving the implementation of the process according to the invention on an industrial scale.

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Selon un mode de réalisation avantageux, ledit dispositif de rinçage est constitué par au moins deux pompes à aspiration et refoulement, l'une et/ou l'autre, lesdites pompes assurant d'une part, sous l'effet de la présentation de l'échantillon à analyser, le passage de l'échantillon à analyser et du liquide de gaine dans ladite cellule de mesure, et d'autre part le rinçage étant activé par arrêt de l'une des pompes et refoulement par l'autre pompe, sous l'effet du retrait de l'échantillon du porteéchantillon. According to an advantageous embodiment, said flushing device comprises at least two pumps for suction and discharge, one and / or the other, said pumps ensuring on the one hand, under the effect of the presentation of the sample to be analyzed, the passage of the sample and the sheath liquid into said measuring cell, and on the other hand rinsing being activated by stopping the pumps and a discharge from the other pump, in the effect of withdrawal of the sample from sample holder.

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Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention et à une description détaillée de l'installation avec référence aux dessins annexés, qui illustrent un mode de réalisation de l'installation et dans lesquels : Besides the above provisions, the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the process according to the invention and a detailed description of the Installation with reference to the accompanying drawings, which illustrate an embodiment of the installation and in which:

Il doit être bien entendu, toutefois, que les exemples, les dessins et les parties descriptives correspondantes sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that the examples, drawings and the corresponding descriptive parts are given solely by way of illustration of the object of the invention, which they do not in any way constitute a limitation.

Il est possible, selon la/les espèce(s) de levure à rechercher, de choisir le colorant de viabilité et/ou les anticorps anti-levures les plus appropriés à ladite levure. It is possible, according to / the kind (s) of yeast to search, to select the dye of viability and / or the most appropriate anti-yeast antibodies to said yeast.

On a en abscisse le canal de fluorescence représentant l'intensité de lumière et en ordonnée le nombre de cellules par canal. in abscissa there is the fluorescence channel representing the intensity of light and the ordinate the number of cells per channel.

La figure 8 représente un histogramme de population de bactéries du genre Lactobacillus détecté dans un échantillon de bière naturellement contaminé. 8 shows a population histogram of the genus Lactobacillus bacteria detected in a sample of naturally contaminated beer.En abscisse on a le canal de fluorescence, et en ordonnée le nombre de particules par canal. In abscissa there is the fluorescence channel, and the ordinate the number of particles per channel.Les particules les plus fluorescentes sont celles qui présentent un métabolisme très actif. The most fluorescent particles are those which have a very active metabolism.

La figure 9 représente un histogramme d'une population de Candida parapsilosis contaminant une sauce béarnaise. Figure 9 shows a histogram of a population of Candida parapsilosis contaminant béarnaise sauce.En abscisse, on a le canal de fluorescence, et en ordonnée le nombre de micro-organismes par canal. Abscissa was the fluorescence channel, and the ordinate the number of microorganisms per channel.

L'analyse de l'échantillon dans l'installation conforme à l'invention, permet, après dilution adéquate, dans un délai de l'ordre d'une minute, de déterminer le pourcentage de spores germées et leur nombre total. The sample analysis in the installation according to the invention makes it possible, after adequate dilution within the range of one minute to determine the percentage of germinated spores and their total number.

Une population de levures est inoculée dans un mout de bière à une concentration de 10⁶ cellules/ml. A yeast population is inoculated into a beer wort at a concentration of 10⁶ cells / ml.Une solution de colorant de viabilité, colorant spécifiquement les levures est ajoutée à une concentration de 1 %. A viability dye solution, specifically staining the yeast is added to a concentration of 1%.Une incubation de 5 min à 45°C colore les levures que l'on peut ensuite compter, à l'aide de l'installation conforme à l'invention. Incubation for 5 min at 45 ° C colored yeast which can then count using the installation according to the invention.Dans ce cas, on peut déterminer d'une part, que le nombre de cellules vivantes diminue, et que d'autre part l'activité métabolique moyenne de la population augmente (intensité moyenne de fluorescence sur les histogrammes) : l'activité globale de la population augmente (fermentation réussie) même si le nombre de cellules n'augmente pas (chiffre donné par les méthodes classiques) (figure 11). In this case, one can determine the one hand, the number of living cells decreases, and on the other hand the average metabolic activity of the population increases (mean fluorescence intensity on the histograms): the overall activity of the population increases (successful fermentation) even if the number of cells does not increase (figure given by conventional methods) (Figure 11).

Après une incubation de 10 minutes à 40°C, l'échantillon est passé dans le cytomètre conforme à l'invention. After a 10 minute incubation at 40 ° C, the sample is passed through the cytometer according to the invention.La figure 13 illustre le résultat d'une analyse dans laquelle le pic de gauche représente la population de bactéries et le pic de droite la population de levures. 13 illustrates the result of an analysis wherein the peak on the left is the population of bacteria and the right peak of the yeast population.L'appareil permet de déterminer les nombres totaux de cellules dans chaque pic (figure 1 3). The apparatus used to determine the total numbers of cells in each peak (Figure 1 3).

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ces modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; As is apparent from the foregoing, the invention in no way limited to those of these modes of implementation, execution and application which have just been described more explicitly;elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. it encompasses all variants which may occur to the specialist in the field, without departing from the framework or the scope of the present invention.