By a phage-display method, antibody (Fab fragment) expressing phage libraries were constructed from peripheral blood lymphocytes of a patient having high titer of anti-IL-1alpha IgG autoantibodies in her serum. By 4 cycles of panning, anti-IL-1alpha Fab expressing phages were isolated and soluble Fab fragments produced from cloned Fab-phages were examined for their binding to IL-1alpha. Of over 50 Fab clones, only several clones revealed significant binding to IL-1alpha. From these findings, we postulated that misfolding during synthesis of Fab molecules is the reason why low incidence of functional Fab molecules. To examine this possibility, we produced soluble Fab molecules from cloned Fab-phages derived from monoclonal anti-DNA antibody (IgM) producing cell line (NE-1) and examined the bindings of individual Fab clones to DNA.Again, only several Fab clones of over 50 clones revealed weak bindings to DNA.Although soluble Fab were less functional, Fab fragments expressed on phages con
… Morestantly bound to DNA at very low concentrations (-100ng/ml). Accordingly, Fab molecules expressed on the surface of phages kept functions of antibody activities, whereas soluble Fab molecules were much less functional. From these findings, we consider that the affinity of our recombinant anti-IL-1alpha antibodies (Fab) made by this method may be much higher than the affinity evaluated previously and so we are reevaluating the recombinant anti-IL-1alpha Fab fragments made by this method previously with Fab-phages, but not with soluble Fab molecules. If affinity of the recombinant anti-IL-1alpha Fab expressed on phages is very high, we intend to produce recombinant anti-IL-1alpha IgG molecules by the conventional method for making chimera IgG molecules.以上の結果よりFabあるいはscFvが大腸菌内で作られる過程でmisfoldingを起こし、抗体活性が失われる可能性が示唆された。以上の点を検討するため、モノクローナル抗DNA抗体産生細胞株を用いて、同じ重鎖、軽鎖の組み合わせからなるリコンビナント抗体Fabを作成し、抗体活性を調べた。数十のFabクローンをこの方法で作成し抗体活性を調べたところ、わずかに数クローンにのみDNA結合活性が見られた。結合活性はもとのIgM抗体よりはるかに弱かった。一方、抗体活性をFabを発現したファージを直接用いて調べたところ、はるかに少ない抗体分子の量(濃度)でDNAに対する結合活性が証明され、ファージ上では可溶化したよりはるかに安定的に機能を保った状態でFabを発現していることが判明した。以上の研究結果から、この方法で得られた可溶性Fabでは、もとの抗体より結合活性が見かけ上はるかに低くなること、これは、Fabが産生される過程でmisfoldingが起こり、多くのFab分子の機能が失われることによることがわかった。一方、ファージ上に発現されたFabは安定的に抗体活性を保持していることがわかった。以上の結果より、我々はすでに高親和性の抗ILー1α抗体Fabを得ている可能性が高く、今後、ファージ上に発現させた状態で抗ILー1α抗体活性を再度調べる予定である。高親和性の抗体が得られていたら、抗体分子の作成は、通常のキメラ抗体作成技術でIgG分子を構築し、抗体活性を調べてゆく予定である。 Less