A fertilizing mammalian sperm penetrates into zona pellucida, an extracellular matrix surrounding oocyte, to fuse the plasma membranes of both cells. It is a general concept that as a consequence of acrosome reaction of sperm, the acrosomal components are released, and interact with the zona pellucida. Acrosin, an endoprotease with a trypsin-like cleavage specificity, is localizing in the acrosome matrix as an enzymatically inactive zymogen, proacrosin. The physiological function of acrosin has long been believed to be a limited proteolysis of the zona pellucida, enabling sperm to penetrate to the oocyte surface. Here we show that male mice homozygous for a targeted mutation in the acrosin gene are still fertile in spite of the complete loss of the acrosin protease activity in the sperm. In vitro fertilization test reveals a time delay of the homozygous mouse sperm in penetrating into the zona pellucida. This delay is likely due to the fact that production of a 42-kDa serine protease i
… Mores suppressed in vitro in the homozygous mouse sperm. Therefore, acrosin is not essential for the penetration of sperm into the zona pellucida. Rather, the function of acrosin in the early stages of fertilization may be implicated in the acceleration of formation of the active 42-kDa trypsin-like protease that is a candidate for the protein acting on the sperm penetration.精子の透明帯侵入・通過機構に関しては,統一的な見解はないもののアクロソーム内にあるタンパク質分解酵素によって透明帯が限界分解され,精子自身の運動性により通過するという考え方が一般的である。精子アクロソームに局在するトリプシン様セリンプロテ-ゼアクロシンは,その透明帯分解の役割を果たしている酵素として考えられてきた。標的遺伝子組換え法を用いてアクロシンを欠損する変異マウスを作製・解析した結果,その変異マウスは野性種と同等の自然交配能を有していることが判明した。そこで,アクロシン欠損マウスの精巣上体精子についえ検討したところ,野生種のものよりも卵透明帯への精子の侵入・通過に有意な遅延が認められた。また,アクロシン以外の新規セリン系プロテアーゼが精子に存在することも見い出された。この新規セリンプロテアーゼ遺伝子の同定とクローンの単離を試み,その候補者としてカッパインをコードするcDNAと染色体遺伝子クローンを単離・解析した。マウスカッパインは前駆体プロテアーゼとして合成され,36残基の軽鎖と300残基の重鎖がひとつのジスルフィド結合により連結されているような成熟型酵素にプロセシングされることが明らかとなった。マウスカッパイン遺伝子は,全長約5キロ塩基対で5個のエクソンより構成されており,マウス染色体上でシングルコピーとして存在することも明らかとなった。また,カッパイン遺伝子は精巣特異的に発現しており,精子形成過程ではほかのアクロソームタンパク質遺伝子と同様にパキテン期精母細胞ですでに転写が開始しており,半数体積細胞でその発現が最も盛んであった。組織化学的な観察より,カッパインはアクロソーム下部,あるいはアクロソームと接する赤道部上端に沿った限定された部位に局在していることが判明した。このカッパインの生体内機能解析のために,ターゲティングベクターを構築してES細胞経由で遺伝子相同組換えを試み,目的のES細胞クローンを単離した。現在,カッパイン遺伝子に変異を生じているキメラマウスより,カッパインを完全に欠損する変異マウスを作製中である。 Less