Taka-amylase A (Taa), one of alpha -amylases,is inducibly synthesized and secreated by Aspergillus oryzae. We investigated the expression regulatory mechanism of the Taa gene from Aspergill us oryzae by using Aspergillus nidulans as an intermediate host. The induction of Taa was shown to be regulated at the transcription level by analyzing the transcripts specific for Taa gene synthesize dinnuclei isolated from starch-and glucose-grown cells, A. nidulans carrying the A.oryzae Taa gene. Taa gene specific transcript was detected only in the nucl ei isolated from cells grown under the inducible conditions, namely starch-grown cells. Potential candidates for sequence elements essential for starch inducibility are present upstream of the transcription start point;a CCAAT box, a GC box, an octermer motif-like sequence. Full inducibility was preserved up to deletion-362,as long as the CCAAT sequence was intact. Further analysis showed that a 55bpDNA fragment containing the CCAAT sequence was
… Morelong enough to confer starch inducibility on the Taa gene. Nuclear extracts from starch-and glucose-grown cells were assayed for proteins which bind to the promoter region of the Taa gene. A protein designated AnCP 1 was detected in nuclear extracts of both starch-and glucose-grown cells and was found to bind to the CCAAT sequence. Unexpectedly,the other DNA binding protein designated AnNP1 was detected in the nuclear extract of glucose grown cells and was found to bind to the 25bp region just upstream of the AnCP1 binding site. Occupancy of the two binding sites appeared to be mutually exclusive, which is suggestive of a negative regulatory mechanism for Taa gene expression.Asper gill us nidulansを宿主にした各種改変Taa遺伝子の発現解析結果より、Taa遺伝子の転写開始点から上流325bpDNA断片上にTaa遺伝子の発現を制御する活性の存在する事を明らかにした。また、この325bpDNA断片には高等真核生物の遺伝子の発現を調節すると考えられている特徴的な塩基配列(シスエレメント)、CCAAT配列やGC配列が存在し、Taa遺伝子の誘導発現に関係していると示唆された。次に、これらシスエレメントに特異的に結合し、Taa遺伝子の発現を調節する核タンパク質(トランス-ファクター)を解析した。上記325bp断片及びCCAAT配列のみを含む133bp断片をプローブに用いてゲルシフト法により、トランス-ファクター様核タンパク質が存在する事を明らかにした。また、同時に結合配列の特異性を合成オリゴヌクレオチドを使用して解析し、二種類のトランス-ファクター、AnCP1(Asper gill us nidulans CCAAT element binding protein 1)及びAnNP1(Asper gill us nidulans nuclear protein 1)が存在する事を示した。更に、これらのファクターがどのようにTaa遺伝子の誘導発現に関与しているかを解析した。AnNP1はグルコースをC源にした非誘導条件でのみ核中に認められるが、AnCP1は非誘導条件でも、可溶性デンプンをC源とした誘導条件でも核中に存在する。AnNP1は一種のリプレッサーであり、非誘導状態ではAnCP1の転写活性化を阻害する。一方、誘導条件下ではAnNP1は合成されず、AnCP1は合成されず、AnCP1が転写を活性化してタカアミラーゼAが合成、分泌されると結論した。 Less