Abstract

The electro-chemical sensor for the determination of an analyte e.g. glucose in a fluid medium such as blood, plasma, serum or extra-cellular tissue fluid, comprises a working- and a reference electrode, and a counter electrode. The working electrode comprises particles of an electrocatalyst in an electrode matrix (20 wt.%). An enzyme suitable for determining the analyte is covalently bound to the electrocatalyst particle. The electrode matrix is porously formed and comprises a conductive electrode material. The electrocatalyst particles (90%) have a diameter of 0.5-5 mu m. The electro-chemical sensor for the determination of an analyte e.g. glucose in a fluid medium such as blood, plasma, serum or extra-cellular tissue fluid, comprises a working- and a reference electrode, and a counter electrode. The working electrode comprises particles of an electrocatalyst in an electrode matrix (20 wt.%). An enzyme suitable for determining the analyte is covalently bound to the particles of the electrocatalyst. The electrode matrix is porously formed and comprises a conductive electrode material. The electrocatalyst particles (90%) have a diameter of 0.5-5 mu m, an enzyme activity of 0.1-10 U/mg, and a functional surface, to which the enzyme is bound directly via a cross-linking reagent. The counter electrode is coated with a conductive material. The sensor contains two sections, where the first section comprises the electrodes, is provided with a biocompatible coat and is contacted with the fluid medium, and the second section is present in an area inaccessible for fluid medium. The biocompatible coat is formed by applying a prefabricated membrane or a solution of a polymer on the sensor and has a thickness of 100-250 mu m. The second section comprises a data-logging unit, a voltage source, a wireless data-transmission unit or a display for indicating measured value, and an interface for a measured value indicator separately from the electro-chemical sensor. An independent claim is included for a method for the production of an electro-chemical sensor.

Als Redoxmediatoren kommen sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Redoxpaare in Betracht. As redox mediators, both naturally occurring and synthetic redox couples are suitable.Für in vivo -Anwendungen sind synthetische Redoxmediatoren, wie sie beispielsweise von For in vivo applications are synthetic redox mediators, such as those of] beschrieben werden, allerdings wenig geeignet. ] Are described, but not very suitable.Dies liegt darin begründet, dass ein synthetischer Redoxmediator theoretisch stets eine Immunantwort des Körpers bei Einbringung des Biosensors in den Körper hervorrufen kann. This is due to the fact that a synthetic redox mediator can elicit an immune response of the body when introduced into the body of the biosensor theoretically always.Zumindest jedoch muss die Toxizität dieser Substanzen beachtet und gegebenenfalls überprüft werden, da Redoxmediatoren prinzipiell frei durch die Elektrodenstruktur diffundieren können müssen, womit sie auch aus der Elektrode austreten bzw. in den sie umgebenden Organismus übertreten können. At least, however, the toxicity of these substances has to be considered and reviewed as appropriate, as redox mediators can diffuse freely through the electrode structure in principle, must which they also emerge from the electrode and into which they can pass surrounding organism.Bei ex vivo -Anwendungen ist dieser Punkt nicht relevant, sofern sichergestellt ist, dass es nicht über einen potentiellen Rückfluss des Analyten zum Eintritt in den Körper kommt. For ex vivo applications, this point is not relevant, if it is ensured that it does not come into the body over a potential return of the analyte to enter.

Ein zusätzliches Problem, welches mit der Bildung von Wasserstoffperoxid im Rahmen der enzymatischen Bestimmung eines Analyten verbunden ist, ist jenes, dass Wasserstoffperoxid als Inhibitor des Analyten oder des Co-Substrats Sauerstoff fungieren kann. An additional problem that is associated with the formation of hydrogen peroxide during the enzymatic determination of an analyte, that is, that peroxide may act oxygen as an inhibitor of the analyte or of the co-substrate.Diese kompetitive Hemmung zeigt eine Abhängigkeit von der Konzentration des Wasserstoffperoxids und führt zu einer Einschränkung des Umsatzes an Analyt. This competitive inhibition is a function of the concentration of the hydrogen peroxide, resulting in a limitation of turnover of analyte.Die Verwendung eines Elektrokatalysators, welcher die Reoxidation von Wasserstoffperoxid zu Sauerstoff fördert, wirkt sich folglich auch in Bezug auf den Umsatz des Analyten positiv aus. The use of an electrocatalyst which promotes the re-oxidation of hydrogen peroxide to oxygen, and consequently has a positive effect also with respect to the conversion of the analyte.

Im Rahmen der Konzipierung elektrochemischer Biosensoren sind verschiedene Faktoren zu berücksichtigen. As part of the design of electrochemical biosensors are several factors to consider.So müssen die Biosensoren eine ausreichende Menge an Enzym in der Arbeitselektrode aufweisen, um eine Enzymlimitierung der Messung zu verhindern [ Thus, the biosensors must have a sufficient amount of enzyme in the working electrode, [to prevent enzyme limitation of the measurement]. ].Ferner sollten die Enzymmoleküle über die komplette Messdauer des Biosensors in der Struktur der Arbeitselektrode lokalisiert sein, dh es sollte nicht zu Ablösungen und Verlagerungen des Enzyms in Bereichen der Elektrode kommen, die vom Messmedium erreicht werden [ Furthermore, the enzyme molecules over the entire measurement period of the biosensor should be located in the structure of the working electrode, that it should not become detached and relocation of the enzyme in areas of the electrode, which can be reached from the surrounding medium []. ].Schließlich sollte das Enzym in der Arbeitselektrode des Biosensors auch stabil sein. Finally, the enzyme in the working electrode of the biosensor should also be stable.Faktoren, welche die thermische Deaktivierung von Enzymen in elektrochemischen Biosensoren bewirken, sind, gemeinsam mit Methoden zur Stabilisierung, vielfach untersucht worden [ Factors which effect the thermal deactivation of enzymes in electrochemical biosensors are, together with methods for stabilization, has been widely studied []. ].Der Enzymabbau nach Herstellung eines Biosensors führt schlussendlich zu einer eingeschränkten Lagerfähigkeit des Sensors. The enzyme degradation by producing a biosensor ultimately leads to a limited shelf life of the sensor.

Um obigen Faktoren Rechnung zu tragen, wurde eine Stabilisierung des Enzyms durch Immobilisierung in der Elektrodenmatrix der Arbeitselektrode angestrebt, was zu einer intensiven Suche nach geeigneten Immobilisierungsverfahren für Enzyme in elektrochemischen Biosensoren geführt hat. To the above factors into account, a stabilization of the enzyme immobilized in the electrode matrix of the working electrode was sought, which has led to an intensive search for suitable immobilization of enzymes in electrochemical biosensors.In der Praxis kommen sowohl eine adsorptive als auch eine chemische Immobilisierung zur Anwendung. In practice, both a adsorptive and chemical immobilization used.Die adsorptive Immobilisierung ist jedoch in verschiedener Hinsicht nachteilig. However, the adsorptive immobilization is disadvantageous in several respects.Zum einen erfordert sie eine Abdeckung der Arbeitselektrode mittels einer für das Enzym undurchlässigen Membran, was den Aufwand bei der Herstellung des Biosensors erhöht und vielfältige Anforderungen an die Membran stellt. Firstly, it requires a cover of the working electrode by means of an impermeable membrane for the enzyme, which increases the cost in the production of the biosensor and provides a wide range of demands on the membrane.Andererseits kann die vorstehend genannte Verlagerung von Enzymmolekülen innerhalb der Elektrode bei adsorptiver Immobilisierung nicht unterbunden werden, was zu einer Veränderung der Sensorfunktion führt. On the other hand, the above-mentioned shift of enzyme molecules within the electrode in adsorptive immobilization can not be prevented, which leads to a change in the sensor function.

US5,368,707 US5,368,707offenbart Biosensoren, welche Arbeitselektroden mit adsorptiv gebundenem Enzym umfassen und zur Bestimmung mikromolarer Mengen an Bleiionen in Flüssigkeiten geeignet sind. discloses biosensors, which include working electrodes with adsorptively bound enzyme and are suitable for the determination of micromolar amounts of lead ions in liquids.Zur Herstellung der Biosensoren wird die aus einem leitfähigen Material bestehende Oberfläche der Arbeitselektrode mit kolloidalem Gold beschichtet, an dessen Partikel das entsprechende Enzym, welches seinerseits kovalent an einen Redoxmediator gebunden sein kann, adsorbiert ist. For the preparation of the biosensors which consists of a conductive material surface of the working electrode is coated with colloidal gold, to the particles the corresponding enzyme, which in turn can be covalently bound to a redox mediator, is adsorbed.

Ein weiterer, insbesondere für in vivo -Anwendungen nicht zu unterschätzender Nachteil von Elektroden, welche eine Deckmembran zur Unterstützung der adsorptiven Immobilisierung von Enzymen vorsehen, besteht in der erforderlichen nicht-invasiven Prüfung der Integrität der Deckmembran. A further, particularly for not be underestimated in vivo applications disadvantage of electrodes which provide a cover membrane to support the adsorptive immobilization of enzymes, is in the required non-invasive examination of the integrity of the cover membrane.Da selbst kleinste Fehlstellen in der Membran genügen, um ein Ausbluten des Enzyms aus der Elektrode in die Umgebung zu bewirken, ist insbesondere bei in vivo -Biosensoren ein enormer Prüfaufwand erforderlich. Since even suffice smallest defects in the membrane to cause bleeding of the enzyme from the electrode into the surrounding area, an enormous testing is required in particular in in vivo biosensors.In Anbetracht der Nachteile einer adsorptiven Immobilisierung besteht somit ein konkretes Bedürfnis, Enzyme in elektrochemischen Biosensoren über kovalente Bindungen an oder in der Elektrodenmatrix zu fixieren. In view of the disadvantages of the adsorptive immobilization thus there is a specific need, enzymes in electrochemical biosensors via covalent bonds on or in the electrode matrix to be fixed.

Ein wesentlicher Nachteil der in A major drawback of inJP 10-68651 JP 10-68651, .EP 0 247 850 A1 EP 0247850 A1und andEP 0 603 154 A2 EP 0603154 A2beschriebenen elektrochemischen Biosensoren besteht darin, dass die Immobilisierung des Enzyms erst an der ohne Enzym vorgefertigten Elektrode erfolgt. electrochemical biosensors described is that the immobilization of the enzyme occurs only at the pre without enzyme electrode.Dies bringt das Problem mit sich, dass die Ankopplung des Enzyms an die Elektrodenbestandteile nicht kontrolliert werden kann. This brings about a problem that the coupling of the enzyme to the electrode components can not be controlled.So bindet das Enzym bei Verwendung von Glutardialdehyd als Vernetzungsreagenz nicht nur unkontrolliert an beliebige reaktive Bestandteile des Elektrodenmaterials, sondern vernetzt auch untereinander. Thus, the enzyme binds when using glutaraldehyde as crosslinking reagent not only uncontrolled linked to any reactive components of the electrode material, but also with each other.Darüber hinaus verursacht diese Vorgehensweise eine Kontamination der Elektrode mit den eingesetzten Reagenzien, womit die Elektrode insbesondere vor Verwendung in einem in vivo -Biosensor nochmals gründlich gereinigt werden muss, was den Produktionsaufwand und somit die Kosten erhöht. In addition, this approach causes contamination of the electrode with the reagents used, with which the electrode must again particularly in use in an in vivo biosensor to be thoroughly cleaned, which increases production costs and thus the cost.

US 4,938,860 US 4,938,860offenbart eine für elektrochemische Sensoren geeignete Elektrode, umfassend eine mit Platin beschichtete, als Film ausgebildete Anode und eine Enzymschicht, welche an die Anode gebunden ist. discloses a suitable electrode for electrochemical sensors, comprising a surface coated with platinum, formed as a film anode, and an enzyme layer, which is bonded to the anode.Die Bindung der Enymschicht an die platinierte Anode erfolgt bevorzugt unter Verwendung eines Aminosilans und eines geeigneten Vernetzungsmittels, wie beispielsweise Glutardialdehyd. The binding of the Enymschicht to platinised anode is preferably carried out using an aminosilane and an appropriate crosslinking agent such as glutaraldehyde.Ein Nachteil der in A disadvantage of inUS 4,938,860 US 4,938,860beschriebenen Elektrode besteht jedoch darin, dass aufgrund der Ausbildung der Anode als Film lediglich eine geringe Oberfläche für die enzymatische Umsetzung des Analyten bereitgestellt und mit Platin als Katalysator ein vergleichsweise teures Material verwendet wird. However, electrode described is that is due to the formation of the anode provided only as a film has a low surface for the enzymatic conversion of the analyte and used with platinum as a catalyst, a relatively expensive material.

Die Referenzelektrode des erfindungsgemäßen elektrochemischen Sensors dient zur Einstellung des Polarisationspotentials der Arbeitselektrode und kann aus einem beliebigen Material bestehen, welches für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet ist. The reference electrode of the electrochemical sensor according to the invention is for adjusting the polarization potential of the working electrode and can be made of any material which is suitable for the purposes of the present invention.Bevorzugt wird als Referenzelektrode eine Silber/Silberchlorid-Elektrode eingesetzt. a silver / silver chloride electrode is preferably used as reference electrode.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen elektrochemischen Sensors, umfassend die Schritte: In a further aspect, the present invention relates to a process for the preparation of an electrochemical sensor according to the invention, comprising the steps of:

Zur Bestimmung des Analyten kann der erfindungsgemäße elektrochemische Sensor in einer beliebigen Art und Weise ausgestaltet sein, welche einen Kontakt zwischen dem elektrochemischen Sensor und dem fluiden Medium ermöglicht. For the determination of the analyte, the electrochemical sensor of the invention in any way can be designed which allows contact between the electrochemical sensor and the fluid medium.So kann der Sensor beispielsweise als Durchflusszelle ausgebildet sein, durch welche das den Analyten enthaltende fluide Medium hindurchströmt. Thus, the sensor may be formed for example as a flow cell through which the fluid medium containing the analyte flows therethrough.Andererseits kann der Sensor auch als Diffusionssensor ausgebildet sein, wobei der Kontakt zwischen Sensor und Medium durch Diffusion erfolgt. On the other hand, the sensor can also be formed as a diffusion sensor, wherein the contact between the sensor and the medium occurs by diffusion.Gleichermaßen kann der elektrochemische Sensor als Vorrichtung ausgebildet sein, welche für eine vollständige oder teilweise Implantation in den Körper eines Patienten vorgesehen ist, wobei die Implantation entweder in ein Blutgefäß oder in Gewebe, insbesondere in subkutanes Fettgewebe, erfolgen kann. Similarly, the electrochemical sensor can be configured as a device which is provided for complete or partial implantation into the body of a patient, the implant can either be effected in a blood vessel or tissue, particularly in subcutaneous fat.