Since several amino-terminal amino acid sequences determined from peptides isolated from Descemet's membranes were found within deduced amino acid sequence from the cDNA clones we isolated, we designated the polypeptide chain as alpha1(VIII) chain. We have isolated genomic DNA encoding the rabbit alpha1(VIII) chain. Intriguingly, the gene contains three small and one large exons. The largest exon contains a short NC2 domain, the entire COL and NC1 domains and 3' UTR. The human gene, COL8A1, has been assigned to chromosome 3q11.1-q13.2. The question here was whether the molecule contains another alpha chains. A set of PCR primers was designed and the PCR products were screened by various probes. The amino acid sequence deduced from a candidate clone contained several collagenous amino acid sequences obtained from Descemet's membrane that were not found in the alpha1(VIII) chain, therefore we identified the collagenous polypeptide as the second chain, alpha2(VIII), that joins the type VI
… MoreII collagen molecule. The gene coding for the alpha2(VIII) chain was assigned to chromosome 1p32.3-1p34.3. Mouse cDNA and genomic DNA clones were isolated and the expression in various tissues and cells were demonstrated by Northern-blot analyzes and in situ hybridization. The results showed that the alpha1(VIII) mRNA is predominantly expressed in keratinocytes, corneal endothelial and epithelial cells, lens epithelial cells as well as mesenchymal cells surrounding cartilage and calvarial bone and in the meninges surrounding the brain.In order to know the biological function of type VIII collagen molecule, we are now trying to create transgenic animals. The first experiment we have done so far was to use presumptive regulatory region of type VIII collagen gene joined to Lac Z gene. Several lines of transgenic mice we obtained did not show typical expression features of the Lac Z gene. Upstream region of type VIII collagen gene needs to characterized further.血管系における内皮平滑筋細胞由来のマトリックス構築の研究の中で、培養ヒト大動脈内皮細胞由来RNAよりα1(VIII)mRNAおよびα2(VIII)RNAを検出することができた。これらのmRNAサイズは上述した家兎角膜内皮細胞由来のRNA中のα1(VIII)mRNAのものと同じであった。さらにこの培養ヒト大動脈内皮細胞はα1(IV),α2(VI),α5(IV),α6(IV)の他α2(I),α1(III),α2(V)等のコラーゲンmRANを産生していることがわかった。さらに平滑筋細胞でもα1(VIII)mRNAが大量に産生していることが判明した。VIII型コラーゲン遺伝子がかなり広範囲に分布しているらしいことがわかってきているが、発生や分化の過程でどの時期にいつ、どのような種類の細胞で発現されるかをトランスジェーニックマウスを用いて検討している。方法としては、VIII型コラーゲン遺伝子発現を制御していると思われる5′側上流域をクローニングして、この領域からの遺伝子発現をレポーター遺伝子としてLacZ遺伝子を用いて行っている。トランスジェーニック作成の技術に関しては、種々の方法を試したところ、現在の方法を用いて特に問題なく目的の遺伝子が導入されているようである。しかしいくつかのトランスジェーニックマウスの系統が得られているが、その系統によってレポーター遺伝子の発現パターンが異なっているため、統一した見解が得られていない。現在ある長さの5′側上流域をVIII型コラーゲン遺伝子の発現に必須の領域と考えて実験を行っているが、このようなVIII型コラーゲン遺伝子の発現に必須の領域に加えて、VIII型コラーゲン遺伝子の発現に付加的に必要な塩基配列、もしくはタンパク因子が必要かも知れないので、そのような方向からの実験の必要性がでてきている。同様の実験結果は、他の強烈な発現様式を示す遺伝子のプロモーター部分を用いたトランスジェーニックマウスでもみられており、導入する遺伝子のプロモーター部位の性質を検索するのに用いられる。さらには、VIII型コラーゲン遺伝子の中に外来の遺伝子を挿入し、VIII型コラーゲン遺伝子の発現を停止したknock out miceを作製中であり、この操作で生まれてくるマウスになんらかの変化(例えば眼球や血管系の発生が抑制されたりするかも知れない)がくれば、胎児発生の課程におけるVIII型コラーゲン遺伝子の生物学的な機能が推測することが可能になってくると思われる。このプロジェクトも現在進行中のものである。 Less