Abstract

Inserting a tag sequence into a nucleic acid comprises hybridizing an anchor sequence of an anchor oligonucleotide to a sequence segment of a template nucleic acid and synthesizing a new nucleic acid strand that is partially complementary to the template and has a 3' terminal sequence complementary to the nonhybridizing part of the anchor oligonucleotide, thereby forming a double-stranded region. Independent claims are also included for: (1) nucleic acid that is synthesized in a first-strand synthesis and has a 3' terminal tag sequence introduced in a matrix independent manner during first-strand synthesis, where the sequence complementary to the tag sequence is not part of a template nucleic acid; (2) anchor oligonucleotide having an anchor sequence in the 3' region and a tag-template sequence in the 5' region such that the anchor sequence is hybridized and the tag-template sequence is not hybridized to a template nucleic acid during second-strand synthesis, where synthesis of the second strand, which is complementary to part of the template, starts 3' to the hybridization site of the anchor sequence on the template strand and ends at the 5' end of the tag-template sequence by means of a polymerase template switch.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es erstmals, Tag-Sequenzen jeder beliebigen Sequenz bereits während der ersten Polymerase-Reaktion in vorher definierte oder zufällige Sequenzbereiche (die Anker-Sequenz des Anker-Oligonukleotids kann eine zufällige, degenerierte oder spezifische Sequenz sein) in eine Nukleinsäure einzuführen. The inventive method makes it possible for the first time, tag sequences of any sequence already during the first polymerase reaction in pre-defined or random sequence regions (the anchor sequence of the anchor oligonucleotide may be a random, degenerate or specific sequence) into a nucleic acid.Dadurch werden die oben diskutierten, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren dahingehend verbessert, dass für einen Einbau einer Tag-Sequenz in eine Nukleinsäure keine zusätzlichen Schritte notwendig sind, was Zeit- und Kosten-sparend ist. Thereby be improved in those discussed above, are known from the prior art methods is that no additional steps are necessary for installation of a tag sequence in a nucleic acid, which is time and cost-saving.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann durchgeführt werden, indem jeder der vorgenannten Schritte (a) bis (c) oder ggf. (a) bis (d) nacheinander jeweils in einem separaten Reaktionsgefäß erfolgt. The inventive method can be performed by each of the above steps (a) to (c) or optionally (a) is carried out successively to (d) are each in a separate reaction vessel.In einer weiteren Ausführungsform werden die Schritte (a) bis (c) oder ggf. (a) bis (d) in ihrer Gesamtheit oder zwei oder mehr der genannten Schritte in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt werden, wodurch eine zusätzliche Zeitersparnis erreicht werden kann. In a further embodiment, more of the above steps in a single reaction vessel, the steps (a) to (c) or optionally (a) to (d) in its entirety or two or will be carried out, whereby an additional time savings can be achieved.

Grundsätzlich beschrieben sind RNA-Amplifikationsverfahren zB in der US-Patentschrift 5,545,522. RNA amplification such as are described in principle in US patent 5,545,522.Bei diesem Verfahren entsteht eine RNA, die in antisense-Richtung zur Ausgangs-mRNA orientiert ist. In this method, an RNA that is oriented in the antisense direction to the starting mRNA is produced.Bei diesem Verfahren ist zwingend eine Zweitstrang-cDNA-Synthese notwendig, um nachfolgend eine in vitro Transkription (Amplifikation) einer RNA zu erreichen. In this method, a second strand cDNA synthesis is imperative to follow an in vitro transcription (amplification) of an RNA to achieve.Benutzt man hingegen ein erfindungsgemäßes Anker-Oligonukleotid, so wird schon während der Erststrang-cDNA-Synthese der RNA-Polymerase Promotor so eingebaut, dass bei der folgenden in vitro Transkription die RNA in sense Richtung transkribiert wird ohne vorherige Zweitstrangsynthese. however, to use an inventive anchor oligonucleotide, so even during the first strand cDNA synthesis of the RNA polymerase promoter is installed so that in the subsequent in vitro transcription, the RNA is transcribed in sense direction without second strand synthesis.Eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen RNA-Amplifikation, bei der während der Synthese des neuen Nukleinsäurestrangs die Promotor-Sequenz mittels der Tag-Template-Sequenz des Anker-Oligonukleotids eingeführt wird, ist in A schematic representation of the RNA amplification according to the invention, wherein the promoter sequence is introduced by means of the tag template sequence of the anchor oligonucleotide during synthesis of the new nucleic acid strand, is in2 2beschrieben. described.

Ferner ist es gemäß einer Ausführungsform der ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt, dass Schritt (c) in Gegenwart mindestens eines Primers durchgeführt wird, von dem aus die Synthese des neuen Nukleinsäurestrangs erfolgt. Further, it is preferable according to one embodiment of the first embodiment of the method according to the invention that step (c) in the presence of at least one primer is carried out, takes place from which the synthesis of the new nucleic acid strand.Der eingesetzte, mindestens eine Primer kann zB eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid bzw. Protein sein. The inserted, at least one primer may for example be a nucleic acid or a polypeptide or protein.Falls der verwendete Primer ein Nukleinsäure-Primer ist, kann die Sequenz desselben spezifisch, degeneriert oder auch zufällig sein. If the primer used is a nucleic acid primer, the sequence thereof can be specific, degenerate or also happens to be.Es kann des Weiteren von Vorteil sein, wenn der eingesetzte Primer (unabhängig davon, ob dieser eine Nukleinsäure oder ein Protein ist) am 5'-Ende eine Tag-Sequenz aufweist. It may be further advantageous if the primer used having a tag sequence (irrespective of whether this is a nucleic acid or a protein) at the 5'-end.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die in Schritt (d) durchgeführte Prozessierung, die eine RNA-Synthese mittels RNA-Polymerase ist, in Gegenwart von Nukleosid-Triphosphaten (NTPs) und/oder modifizierten NTPs. According to a preferred embodiment of the first embodiment of the method in step (d) performed processing, which is an RNA synthesis by RNA polymerase takes place in the presence of nucleoside triphosphates (NTPs) and / or modified NTPs.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält der mindestens eine in Schritt (c) eingesetzte Primer eine Tag-Sequenz. According to another preferred embodiment of the first embodiment of the method according to the invention the at least one primer in step (c) used comprises a tag sequence.Diese enthält mindestens eine funktionelle Sequenz, wobei mindestens einer der funktionellen Sequenzen ein RNA-Polymerase-Promotor ist. This contains at least one functional sequence at least one of the functional sequences is an RNA polymerase promoter.Die Tag-Template Sequenz des Anker-Oligonukleotids weist ebenfalls mindestens eine funktionelle Sequenz auf, wobei mindestens eine der funktionellen Sequenzen ein RNA-Polymerase-Promotor ist. The tag template sequence of the anchor oligonucleotide also has at least one functional sequence at least one of the functional sequences is an RNA polymerase promoter.In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können Anker-Oligonukleotid und Primer identisch sein. In this embodiment of the inventive anchor oligonucleotide and primers may be identical.Die in Schritt (c) erzeugten doppelsträngigen Enden können nun geschlossen werden, beispielsweise werden die Enden miteinander ligiert (beispielsweise chemisch, enzymatisch). In step (c) double-stranded ends produced may now be closed, for example, the ends are ligated to each other (for example, chemically, enzymatically).Alternativ können diese doppelsträngigen Enden mit einem selbstkomplementären Oligonukleotid ligiert werden. Alternatively, these double-stranded ends can be ligated to a self-complementary oligonucleotide.Ein solches selbstkomplementäres Oligonukleotid bildet mit sich selbst ein blunt end und kann beispielsweise mittels Ligase an die doppelsträngigen Enden ligiert werden. Such a self-complementary oligonucleotide forms with itself a blunt end, and may, for example, be ligated to the double-stranded ends by ligase.Über das selbstkomplementäre Oligonukleotid können alternativ auch weitere funktionelle Sequenzen eingeführt werden. About the self-complementary oligonucleotide further functional sequences can be introduced as an alternative.Alternativ zu der Einführung eines RNA-Polymerase-Promotors durch die Tag-Template-Sequenz des Anker-Oligonukleotids und die Tag-Sequenz des Primers kann diese auch mittels des selbstkomplementären Oligonukleotids eingeführt werden. As an alternative to the introduction of an RNA polymerase promoter by the tag template sequence of the anchor oligonucleotide and the tag sequence of the primer, it can also be introduced by means of the self-complementary oligonucleotide.Länge und Sequenz eines solchen selbstkomplementären Oligonukleotids sind vom jeweiligen Versuchshintergrund abhängig und können in diesem Zusammenhang vom Fachmann mit Leichtigkeit bestimmt werden. The length and sequence of such a self-complementary oligonucleotide depends on the respective experimental background and can be determined in this context by the skilled person with ease.Die anschließende, erfindungsgemäße Synthese der RNA erfolgt dann vorzugsweise in Gegenwart einer RNA-Polymerase und von NTPs und/oder modifizierten NTPs. The subsequent, according to the invention the synthesis of the RNA is then preferably effected in the presence of an RNA polymerase and NTPs and / or modified NTPs.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Tag-Sequenz des mindestens einen eingesetzten Primers identisch mit der Tag-Template-Sequenz des Anker-Oligonukleotids sein. According to another preferred embodiment of the first embodiment of the method according to the invention, the tag sequence of the primer used at least one may be identical to the tag template sequence of the anchor oligonucleotide.Die Tag-Sequenz des Primers ist vorzugsweise zumindest partiell identisch zur Tag-Template-Sequenz des Anker-Oligonukleotids. The tag sequence of the primer is preferably at least partially identical to the tag template sequence of the anchor oligonucleotide.Partiell identisch im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass mindestens so viele Nukleotide identisch sind, dass der neu synthetisierte Nukleinsäurestrang an dieser Stelle einen unter den jeweiligen Versuchsbedingungen stabilen Doppelstrang bildet. Partially identical in the sense of the present invention means that at least as many nucleotides are identical to that of the newly synthesized strand of nucleic acid forms a stable under the particular experimental conditions double strand at this point.Hierfür ist erfahrungsgemäß eine Sequenz mit einer Länge von mindestens ca. 6 Nukleotiden notwendig. For this, a sequence with a length of at least about 6 nucleotides experience has shown necessary.In diesem Fall ist es wieder von Vorteil, wenn nach Schritt (c) in Schritt (d) eine Strangtrennung erfolgt, die wiederum zB thermisch, auf enzymatischem Wege und/oder auch chemisch erfolgen kann. In this case, it is again advantageous if after step (c) in step (d) strand separation takes place, which can be carried out enzymatically and / or chemically, in turn, for example thermally.

Die Tag-Sequenz am 5'-Ende des neu synthetisierten Nukleinsäurestrangs kann dabei mit der am 3'-Ende gelegenen, komplementären Sequenz durch Hybridisierung eine Haarnadelschlaufenstruktur ausbilden. The tag sequence at the 5 'end of the newly synthesized strand of nucleic acid can in this case form with the located at the 3' end, complementary sequence by hybridization of a hairpin loop structure.Die erfindungsgemäße Synthese der RNA erfolgt dann vorzugsweise in Gegenwart einer RNA-Polymerase und von NTPs und/oder modifizierten NTPs. The synthesis of RNA according to the invention is then preferably effected in the presence of an RNA polymerase and NTPs and / or modified NTPs.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Tag-Template-Sequenz des Anker-Oligonukleotids und die Tag-Sequenz des Primers in 5'-Richtung der als RNA-Polymerase-Bindestelle fungierenden Sequenz mindestens eine weitere funktionelle Sequenz enthalten. According to another preferred embodiment of the first embodiment of the method according to the invention, the tag template sequence of the anchor oligonucleotide and the tag sequence of the primer can contain in the 5 'direction of acting as an RNA polymerase binding site sequence is at least one further functional sequence.Diese mindestens eine weitere funktionelle Sequenz in der Tag-Template-Sequenz des Anker-Oligonukleotids und in der Tag-Sequenz des Primers ist bevorzugt identisch. This at least one further functional sequence in the tag template sequence of the anchor oligonucleotide and the tag sequence of the primer is preferably identical.Die weitere funktionelle Sequenz ist besonders bevorzugt eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym. The other functional sequence is particularly preferred an interface for a restriction enzyme.Die Haarnadelschlaufenstruktur kann dann an der Restriktionsschnittstelle durch eine Restriktionsendonuklease geschnitten werden. The hairpin loop structure can then be cut at the restriction site by a restriction endonuclease.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Tag-Sequenz des Primers die Tag-Template-Sequenz des Anker-Oligonukleotids beinhalten und außerdem in 5'-Richtung dieser Sequenz mindestens ein weiteres Nukleotid aufweisen. According to another preferred embodiment of the first embodiment of the method according to the invention, the tag sequence of the primer may include the tag template sequence of the anchor oligonucleotide and further comprise at least one further nucleotide 5 'to this sequence.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Tag-Template-Sequenz des Anker-Oligonukleotids die Tag-Sequenz des Primers beinhalten und außerdem in 5'-Richtung dieser Sequenz mindestens ein weiteres Nukleotid aufweisen. According to another preferred embodiment of the first embodiment of the method according to the invention, the tag template sequence of the anchor oligonucleotide may include the tag sequence of the primer and further comprise at least one further nucleotide 5 'to this sequence.

Wird bei den beiden vorgenannten Ausführungsformen ggf. noch ein Prozessierungsschritt (d) durchgeführt, dann ist dieser Schritt vorzugsweise eine Strangtrennung, die wiederum zB thermisch, enzymatisch und/oder chemisch erfolgen kann. If, in the above two embodiments may also have a processing step (d) is carried out, this step is preferably a strand separation, which in turn may for example be carried out thermally, enzymatically and / or chemically.Unter Strangtrennung wird dabei die Trennung des Doppelstranges in die beiden Einzelstränge verstanden, wobei lediglich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden Einzelsträngen gelöst werden. Under strand separation, the separation of the double strand is understood in the two single strands, and only the hydrogen bonds between the two single strands to be solved.

Ferner kann bei den beiden vorgenannten Ausführungsformen durch eine Hybridisierung der Tag-Sequenz am 5'-Ende des neu synthetisierten Nukleinsäurestrangs mit der am 3'-Ende gelegenen komplementären Sequenz eine Haarnadelschlaufenstruktur mit einem Überhang ausgebildet werden. Further, in the above two embodiments, a hairpin loop structure are formed with an overhang with the located at the 3'-end of the complementary sequence by hybridization of the tag sequence at the 5 'end of the newly synthesized strand of nucleic acid.Die Enden zweier Haarnadelstrukturen können ligiert werden. The ends of two hairpin structures can be ligated.Es können alternativ zwei Haarnadelstrukturen mittels einer blunt end Ligation verbunden werden. It can be connected by means of a blunt end ligation, alternatively, two hairpin structures.Dem Fachmann ist bekannt, dass sticky ends mittels einer Polymerase- oder einer Exonuklease-Aktivität zu blunt ends umgewandelt werden können, die dann problemlos ligiert werden können. The skilled worker is aware that sticky ends can be converted by means of a polymerase or an exonuclease activity to blunt ends that can then be ligated easily.Alternativ kann eine Haarnadelstruktur mit einem selbstkomplementären Oligonukleotid ligiert werden. Alternatively, a hairpin structure with a self-complementary oligonucleotide can be ligated.Ein solches selbstkomplementäres Oligonukleotid bildet in diesem Falle mit sich selbst ein sticky end und kann mittels Ligase an die Haarnadelstruktur ligiert werden. Such a self-complementary oligonucleotide forms in this case with itself a sticky end and can be ligated to the hairpin structure by means of ligase.Über das selbstkomplementäre Oligonukleotid können alternativ auch weitere funktionelle Sequenzen eingeführt werden. About the self-complementary oligonucleotide further functional sequences can be introduced as an alternative.Länge und Sequenz eines solchen selbstkomplementären Oligonukleotids sind vom jeweiligen Versuchshintergrund abhängig und können in diesem Zusammenhang vom Fachmann mit Leichtigkeit bestimmt werden. The length and sequence of such a self-complementary oligonucleotide depends on the respective experimental background and can be determined in this context by the skilled person with ease.Eine RNA-Synthese wird dann vorzugsweise in Gegenwart einer RNA-Polymerase und von NTPs durchgeführt. RNA synthesis is then performed preferably in the presence of an RNA polymerase and NTPs.Die gebildete Haarnadelstruktur kann unter Verwendung von dNTPs und/oder modifizierten dNTPs, mindestens eines Primers und einer DNA-Polymerase mit Strand-Displacement-Aktivität zu einem DNA-Template amplifiziert werden. The hairpin structure is formed can be amplified with beach displacement activity to a DNA template using dNTPs and / or modified dNTPs, at least one primer and a DNA polymerase.Die anschließende RNA-Synthese kann dann zB mittels RNA-Polymerase, NTPs und/oder modifizierten NTPs und des erzeugten DNA-Templates erfolgen. The subsequent RNA synthesis can then be effected for example by means of RNA polymerase, NTPs and / or modified NTPs and DNA templates generated.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt (c) mindestens ein Primer für eine Polymerase-Reaktion zugegeben, wobei der zugegebene Primer eine Tag-Sequenz enthält. According to another preferred embodiment of the second embodiment of the method (c) is at least one primer for a polymerase reaction is added in step, wherein the added primer comprises a tag sequence.Nach einem Aspekt dieser zweiten Ausführungsform kann die Tag-Template-Sequenz des Anker-Oligonukleotids des Weiteren die Tag-Sequenz des Primers enthalten, und zusätzlich dazu in 5'-Richtung dieser Sequenz mindestens ein weiteres Nukleotid. According to one aspect of this second embodiment, the tag template sequence of the anchor oligonucleotide may further include the tag sequence of the primer, and, additionally, in the 5 'direction of the sequence of at least one further nucleotide.Gemäß eines anderen Aspekts ist es auch möglich, dass die Tag-Sequenz des Primers die Tag-Template-Sequenz des Anker-Oligonukleotids beinhaltet, und zusätzlich dazu in 5'-Richtung dieser Sequenz mindestens ein weiteres Nukleotid aufweist. According to another aspect, it is also possible that the tag sequence of the primer includes the tag template sequence of the anchor oligonucleotide, and in addition thereto at least one further nucleotide 5 'to this sequence.Im Anschluss an die beiden vorgenannten Aspekte kann dann ggf. in einem weiteren Schritt (d) eine Prozessierung in Form einer Strangtrennung durchgeführt werden, wobei die Strangtrennung vorzugsweise thermisch, enzymatisch und/oder chemisch erfolgt. Following the two aforementioned aspects in a further step (d) a processing in the form of a strand separation can then be performed, if necessary, the strand separation is preferably performed thermally, enzymatically and / or chemically.Ein weiterer Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darauf gerichtet, dass sich durch eine Hybridisierung der Tag-Sequenz am 5'-Ende des neu synthetisierten Nukleinsäurestrangs mit der am 3'-Ende gelegenen komplementären Sequenz eine Haarnadelschlaufenstruktur mit einem Überhang ausbilden kann. A further aspect of the inventive process is directed to the fact that a hairpin loop structure can be formed with an overhang by a hybridization of the tag sequence at the 5 'end of the newly synthesized strand of nucleic acid with the located at the 3' end complementary sequence.Die Enden zweier Haarnadelstrukturen können dann ligiert werden. The ends of two hairpin structures can then be ligated.Dem Fachmann ist bekannt, dass sticky ends mittels einer Polymerase- oder einer Exonuklease-Aktivität zu blunt ends umgewandelt werden können, die dann problemlos ligiert werden können. The skilled worker is aware that sticky ends can be converted by means of a polymerase or an exonuclease activity to blunt ends that can then be ligated easily.Alternativ kann eine Haarnadelstruktur mit einem selbstkomplementären Oligonukleotid ligiert werden. Alternatively, a hairpin structure with a self-complementary oligonucleotide can be ligated.Ein solches selbstkomplementäres Oligonukleotid bildet in diesem Falle mit sich selbst ein sticky end und kann mittels Ligase an die Haarnadelstruktur ligiert werden. Such a self-complementary oligonucleotide forms in this case with itself a sticky end and can be ligated to the hairpin structure by means of ligase.Über das selbstkomplementäre Oligonukleotid können alternativ auch weitere funktionelle Sequenzen eingeführt werden. About the self-complementary oligonucleotide further functional sequences can be introduced as an alternative.Länge und Sequenz eines solchen selbstkomplementären Oligonukleotids sind vom jeweiligen Versuchshintergrund abhängig und können in diesem Zusammenhang vom Fachmann mit Leichtigkeit bestimmt werden. The length and sequence of such a self-complementary oligonucleotide depends on the respective experimental background and can be determined in this context by the skilled person with ease.Eine anschließende DNA-Synthese wird vorzugsweise in Gegenwart einer DNA-Polymerase und von dNTPs und/oder modifizierten dNTPs durchgeführt. A subsequent DNA synthesis is preferably carried out in the presence of a DNA polymerase and dNTPs and / or modified dNTPs.

Die Template-Nukleinsäure gemäß der dritten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann zB DNA oder RNA sein. The template nucleic acid according to the third embodiment of the method according to the invention may for example be DNA or RNA.Vorzugsweise wird für die Detektion der Template-Nukleinsäure eine Amplifikation einer Nukleinsäure durchgeführt. Preferably, an amplification of a nucleic acid is performed for the detection of the template nucleic acid.Bei dieser dritten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können zwei grundlegende Aspekte unterschieden werden. In this third embodiment of the method, two fundamental aspects can be distinguished.Zum einen kann die in Schritt (c) neu synthetisierte Nukleinsäure selbst amplifiziert werden, zum anderen kann die in Schritt (c) neu synthetisierte Nukleinsäure als Primer bei der Amplifikation einer Detektions-Nukleinsäure dienen. Firstly, in step (c) can be re-synthesized nucleic acid itself can be amplified to the other in step (c) can be used newly synthesized nucleic acid as a primer in the amplification of a nucleic acid detection.

Diese Ausführungsform betrifft eine erfindungsgemäße Amplifikation von RNA aus geringen Ausgangsmengen. This embodiment relates to an amplification of RNA from small amounts of starting according to the invention.Eine schematische Darstellung dieser Verfahrensvariante ist in A schematic representation of this process variant is2 2zu finden. to find.

In Abwandlung zur oben beschriebenen Versuchsdurchführung kann zB ein Anker-Oligonukleotid auch derart verwendet werden, dass das Anker-Oligonukleotid neben dem Einbau einer Tag-Sequenz auch den Start der DNA-Synthese vermittelt, also der mit der Template-Nukleinsäure hybridisierende Teil (Anker-Sequenz) als Primer für den neu synthetisierten Strang dient. In a modification of the above-described experimental procedure for example, an anchor oligonucleotide can also be used such that in addition to the incorporation of a tag sequence the anchor oligonucleotide also conveys the start of DNA synthesis, that is, the hybridising with the template nucleic acid part (anchor sequence) serves as a primer for the newly synthesized strand.In diesem Fall muss das Anker-Oligonukleotid ein 3'-Ende, wie zB ein freies 3'-OH-Ende, enthalten, das durch die Polymerase verlängerbar ist. In this case, the anchor oligonucleotide has a 3 'end, for example contain a free 3'-OH end which is extended by the polymerase.

In einer weiteren Abwandlung zur beschriebenen Versuchsdurchführung kann zB ein Anker-Oligonukleotid eine spezifische oder degenerierte Sequenz im Bereich der Anker-Sequenz enthalten, so dass nur eine Sequenz oder eine bestimmte Gruppe von Sequenzen amplifiziert werden kann. In a further modification to the experimental procedure described an anchor oligonucleotide can contain, for example, a specific or degenerate sequence in the region of the anchor sequence, so that only one sequence, or a specific group can be amplified sequences.In einer weiteren Abwandlung können anstatt des Oligo-dT Primers auch Random-Primer, degenerierte Primer oder spezifische Primer verwendet werden. In a further modification and random primers, degenerate primers or specific primers can be used instead of oligo-dT primer.

In einer weiteren Abwandlung zur oben beschriebenen Versuchsdurchführung kann anstelle der RNA auch genomische DNA oder eine andere DNA als Ziel-Nukleinsäure eingesetzt werden. In a further modification to the above-described experimental procedure and genomic DNA or other DNA can be used as target nucleic acid in place of RNA.Dadurch kann zB jede beliebige Sequenz des Genoms in RNA umgewandelt werden. Characterized in any sequence of the genome RNA can be converted for example.

In Abwandlung zur oben beschriebenen Versuchsdurchführung kann zB auch ein Anker-Oligonukleotid mit alternativen RNA-Polymerase-Promotoren verwendet werden. In a modification of the above-described experimental procedure also an anchor oligonucleotide can be used with alternative RNA polymerase promoters, for example.

In einer zweiten Abwandlung zur oben beschriebenen Versuchsdurchführung kann zB auch ein Anker-Oligonukleotid eine spezifische oder degenerierte Sequenz im Bereich der Anker-Sequenz haben, so dass nur ein Transkript oder eine bestimmte Gruppe von Transkripten amplifiziert werden kann. In a second modification to the above-described experimental procedure also an anchor oligonucleotide may for example have a specific or degenerate sequence in the region of the anchor sequence, so that only a transcript or a specific group can be amplified transcripts.

In einer dritten Abwandlung zur oben beschriebenen Versuchsdurchführung kann anstelle der RNA auch genomische DNA oder eine andere DNA als Ziel-Nukleinsäure eingesetzt werden. In a third modification to the above-described experimental procedure and genomic DNA or other DNA can be used as target nucleic acid in place of RNA.Dadurch kann zB jede beliebige Sequenz des Genoms in RNA umgewandelt werden. Characterized in any sequence of the genome RNA can be converted for example.

In Abwandlung zur oben beschriebenen Versuchsdurchführung kann zB ein Anker-Oligonukleotid mit alternativen RNA-Polymerase-Promotoren verwendet werden. In a modification of the above-described experimental procedure, an anchor oligonucleotide can be used with alternative RNA polymerase promoters, for example.

Gemäß einer zweiten Abwandlung zur beschriebenen Versuchsdurchführung kann zB ein Anker-Oligonukleotid eine spezifische oder degenerierte Sequenz im Bereich der Anker-Sequenz aufweisen, so dass nur ein Transkript oder eine bestimmte Gruppe von Transkripten amplifiziert werden kann. According to a second modification to the experimental procedure described an anchor oligonucleotide may for example have a specific or degenerate sequence in the region of the anchor sequence, so that only a transcript or a specific group can be amplified transcripts.

In einer dritten Abwandlung zur beschriebenen Versuchsdurchführung kann anstelle der RNA auch genomische DNA oder eine andere DNA als Ziel-Nukleinsäure eingesetzt werden. In a third modification to the described experimental procedure and genomic DNA or other DNA can be used as target nucleic acid in place of RNA.Dadurch kann zB jede beliebige Sequenz des Genoms in RNA umgewandelt werden. Characterized in any sequence of the genome RNA can be converted for example.

In einer zweiten Abwandlung zur beschriebenen Versuchsdurchführung kann zB ein Anker-Oligonukleotid eine spezifische oder degenerierte Sequenz im Bereich der Anker-Sequenz aufweisen, so dass nur eine Sequenz oder eine bestimmte Gruppe von Sequenzen amplifiziert werden kann. In a second modification to the experimental procedure described an anchor oligonucleotide may for example have a specific or degenerate sequence in the region of the anchor sequence, so that only one sequence, or a specific group can be amplified sequences.Die Anker-Sequenz kann auch eine alternative Länge aufweisen. The anchor sequence may also include an alternative length.

In einer weiteren Abwandlung der in Beispiel 1 beschriebenen Versuchsdurchführung kann zB ein Anker-Oligonukleotid eine spezifische oder degenerierte Sequenz im Bereich der Anker-Sequenz aufweisen, sodass nur eine Sequenz oder eine bestimmte Gruppe von Sequenzen amplifiziert werden kann. In a further modification of the test procedure described in Example 1, an anchor oligonucleotide may for example have a specific or degenerate sequence in the region of the anchor sequence, so that only one sequence, or a specific group can be amplified sequences.Die Anker-Sequenz kann auch eine alternative Länge aufweisen. The anchor sequence may also include an alternative length.

In einer dritten Abwandlung der in Beispiel 1 beschriebenen Versuchsdurchführung kann während der Ligase-Reaktion eine DNA-Polymerase zugegen sein. In a third modification of the experiment described in Example 1, a DNA polymerase may be present during the ligase reaction.Diese kann neben der DNA-Polymerase-Aktivität auch noch eine Exonukleaseaktivität enthalten. This may include in addition to the DNA polymerase activity also an exonuclease activity.Im Falle, dass sich, beispielsweise bei großer Länge der neu synthetisierten Nukleinsäure, keine blunt ends sondern sticky ends bei der intramolekularen Hybridisierung bilden, können die entstehenden Lücken durch die Polymerase aufgefüllt werden. In the event that form, for example at great length of the newly synthesized nucleic acid, no blunt ends but sticky ends in the intramolecular hybridization, the resulting gaps can be filled by the polymerase.

In einer vierten Abwandlung der in Beispiel 1 beschriebenen Versuchsdurchführung kann während der Ligase-Reaktion ein Oligonukleotid zugegen sein, dass durch intramolekulare Hybridisierung eine blunt end Haarnadelstruktur ausbildet und anschließend mit dem blunt end der neu synthetisierten und zur Haarnadelstruktur hybridisierten Nukleinsäure zum geschlossenen zirkulären Nukleinsäuremolekül ligiert wird. In a fourth modification of the experiment described in Example 1, an oligonucleotide may be present during the ligase reaction that by intramolecular hybridization forms a blunt end hairpin structure, and then the newly synthesized and hybridized to the hairpin nucleic acid to the closed circular nucleic acid molecule is ligated with the blunt end ,

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Anker-Sequenz des mindestens einen Anker-Oligonukleotids im 3'-Bereich und die mindestens eine Tag-Template-Sequenz des mindestens einen Anker-Oligonukleotids im 5'-Bereich des mindestens einen Anker-Oligonukleotids gelegen sind. A method according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the at least one anchor sequence of the at least one anchor oligonucleotide in the 3 'region and the at least one tag template sequence of the at least one anchor oligonucleotide in the 5'-region of at least one anchor oligonucleotide located.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (c) eine Polymerase mit geringer oder keiner Strand-Displacement-Aktivität eingesetzt wird. Method according to one of the preceding claims, characterized in that in step (c), a polymerase is used with little or no beach displacement activity.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (c) in Anwesenheit eines Primers durchgeführt wird, von dem die Synthese des neuen Nukleinsäurestranges ausgeht. Method according to one of the preceding claims, characterized in that step (c) is carried out in the presence of a primer from which the synthesis of the new nucleic acid strand.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zur Einführung von mindestens einer Tag-Sequenz in eine Nukleinsäure zur Synthese von RNA dient. A method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the process for introduction of at least one tag sequence is used in a nucleic acid for the synthesis of RNA.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zur Einführung von mindestens einer Tag-Sequenz in eine Nukleinsäure zur Synthese von DNA dient. A method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the process for introduction of at least one tag sequence is used in a nucleic acid for the synthesis of DNA.

DE2006100208852006-05-052006-05-05Inserting a tag sequence into a nucleic acid comprises using an anchor oligonucleotide comprising a hybridizing anchor sequence and a nonhybridizing tag-template sequence
PendingDE102006020885A1
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