The transgene detection is the most time- and money- consuming step in transgenesis. Without this step, transgenesis must be proceeded more efficiently. The aim of our project is to examine the possibility whether tyrosinase minigene can be used to be a visible reporter gene in transgenesis. If succeeded, we can eliminate the transgene detection using genomic DNA extracted from tissue of transgenic candidate animals, which is essential but the most time- and money-consuming step in transgenesis. The conditions for the reporter gene are : 1) its stable expression in authentic tissues such as hair follicle in skin and eye, 2) minimum size as possible because that the reporter gene must be connected with other gene (s) of interest. For examine these respects, we have constructed a new tyrosinase minigene mg-Tyrs-JS with its truncated promoter region, 1.9 Kbp shortened than the previous minigene mg-Tyrs-J constructed by Tanaka et al. (Devel-opment 00 : 000-000,1990) . Introduced into cultu
… Morered mouse L cells by electroporation method, the truncated minigene mg-Tyrs-Js was expressed in the cells. Then, we made transgenic mice using this minigene. Unexpectedly, however, no transgenic mice carrying with this minigene could be obtained with our great efforts, suggesting that the other tissue-specific regulatory element (s) must exist in the eliminated promoter region.本研究では、この事実を逆に利用し、これまでDNA解析が必須であったトランスジーンの検出を、マウスの着色という可視的現象を指標にして行うための検出法の是非を検討することを目的とした。そのためには、導入したトランスジーンの安定な組織特異的発現と、検出マーカーとしての利用のため他の目的とする遺伝子との連結を行うため、チロシナーゼ遺伝子のプロモーター領域のうち、発現とその安定性に関係すると思われる領域のみを残した短縮化チロシナーゼ遺伝子組換え体を作製する必要があった。このため、すでにマウス個体での発現が確認されていた約4.5Kbpのチロシナーゼミニジ-のプロモーター領域を1.9Kbp短縮したミニジーン(2.6Kbp)を作製した。マウス培養細胞を用いた場合、このミニジーンの発現が確認されたので、マウス個体の導入しトランスジェニックマウスの作製を試みた。しかし、約300頭のトランスジェネシス後のマウス受精卵から1頭のトランスジェニックマウスをも得ることができなかった。この原因を追究するため、mg-Tyrs-JS導入後の2細胞期卵からのトランスジーンの検出、着床率、出生率、胚発生段階の状態等の検討から、このミニジーンが強い遺伝毒性を有することが判明した。この遺伝毒性は、このチロシナーゼミニジーンが遺伝子加工により組織特異的発現を欠損したため、チロシナーゼの代謝産物であるL-ドーパ等生理活性を持つ物質が全身的に蓄積したために起こったものと考えられた。現在、このチロシナーゼの組織特異的発現を支配している領域の決定と、ミニジーンの改良を検討中である。 Less